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联合检测登革病毒NS1抗原和RNA核酸在登革热早期快速诊断中的应用

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  [摘要]目的 探讨联合检测登革病毒NS1抗原和RNA核酸在登革热早期快速诊断中的应用价值。方法 366例登革热临床疑似病例血清样品采集自2014年6~11月广东Ⅰ型登革病毒流行期间本院门诊和住院的患者,同时使用ELISA法检测登革病毒NS1抗原和PCR-荧光探针法检测登革病毒RNA核酸,然后对检测结果进行比较。结果 登革热NS1抗原检测阳性率为94.8%,登革热RNA核酸检测阳性率是95.9%,联合检测的阳性率为97.3%,联合检测的阳性率高于其余两者的阳性率。结论 登革病毒NS1抗原和RNA核酸可用于登革热的早期快速诊断,联合检测具有更高的阳性检出率。
  [关键词]登革热;NS1抗原;RNA核酸;联合检测
  [中图分类号] R512.63 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)09(b)-0140-03
  [Abstract]Objective To investigate the application under combined detection of NS1 antigen and RNA nucleic acid of dengue virus in early and rapid diagnosis of dengue fever.Methods 366 clinically dengue fever suspected cases of serum samples were collected from outpatients and inpatients during the epidemic dengue virus type Ⅰ in Guangdong in June to November 2014,while the detection of dengue virus NS1 antigen by ELISA and RNA nucleic acid by PCR fluorescence probe method,and then the result was compared.Results Dengue NS1 antigen test positive rate was 94.8%;dengue RNA nucleic acid testing positive rate was 95.9%,the positive rate of joint detection was 97.3%.The positive rate of combined detection was higher than the other two.Conclusion NS1 antigen and RNA nucleic acid of dengue virus can be used for early and rapid diagnosis of dengue fever,combined detection of the two has a higher positive rate.
  [Key words]Dengue fever;NS1 antigen;RNA nucleic acid;Combined detection
  登革热(dengue fever,DF)是由登革1~4型病毒(DV1~4)引起的一种急性蚊媒传染病。登革病毒感染除引起登革热外,严重的还可导致登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)[1-4]。典型的登革热临床表现为起病急骤,高热,头痛,肌肉和骨关节剧烈酸痛,部分患者出现皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞总数减少、血小板减少等。目前广泛流行于全球热带及亚热带地区,对公共卫生安全和人类健康构成了严重威胁[3]。登革病毒基因组全长约为11 kb,依次编码3种结构蛋白(核蛋白C、膜结合蛋白M和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。其中NS1蛋白是登革病毒的一种高度保守的非结构糖蛋白,存在膜结合型和分泌型两种形式,均具有强免疫原性。登革病毒颗粒呈球形,直径45~55 nm。登革病毒共有4个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4),4种血清型均可感染到人类[5]。登革热诊断常用的血清学和病原学传统检测方法,由于抗体从出现到可检测水平,通常需要5~7 d[6-8],同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应,故血清学检测作为早期诊断方法仍有一定的局限性;DV的分离鉴定是该病最可靠的诊断方法,是病毒鉴定的金标准,但需要生物安全二级(BSL-2)实验室及必要的仪器设备,而且标本运输过程中要求保持低温(冷冻或冷藏),试验耗时较长,需要数天,灵敏度低,不能作为早期诊断方法[9]。近10多年发展起来的DV核酸检测技术,为登革热的早期诊断提供了可能,为病原体的检测和特性分析提供了快速、可靠和灵敏的技术手段,而针对登革病毒特异的抗原、抗体或核酸进行检测主要包括血清学方法和分子生物学等方面,这些诊断方法各具特色,相互补充,临床病例的最终确诊往往需要综合考虑多种方法的检测结果。2014年第一次获得批文应用于临床的登革病毒NS1抗原和RNA核酸检测试剂盒的使用为快速确诊和控制登革热疫情起了关键作用。现将登革病毒NS1抗原和RNA核酸检测结果作初步分析,并报道如下。
  1资料与方法
  1.1一般资料
  共收集疑似病例366例,其中男151例,女215例,均来自中山大学孙逸仙纪念医院2014年6~11月收治的急门诊和住院患者,年龄3~86岁,平均42岁。
  1.2诊断标准
  按照国家卫生计生委的登革热诊疗指南(2014年版):根据流行病学史、临床表现及实验室检查结果,可做出登革热的诊断。在流行病学史不详的情况下,根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果作出诊断。1.2.1疑似病例 符合登革热临床表现,有流行病学史(发病前15 d内到过登革热流行区,或居住地有登革热病例发生),或有白细胞和血小板减少者。
  1.2.2临床诊断病例 符合登革热临床表现,有流行病学史,并有白细胞、血小板同时减少,单份血清登革病毒特异性IgM抗体阳性。
  1.2.3确诊病例 疑似或临床诊断病例,急性期血清检测出NS1抗原或病毒核酸,或分离出登革病毒或恢复期血清特异性IgG抗体阳转或滴度呈4倍以上升高。
  1.2.4重症登革热的诊断 有下列情况之一者:①严重出血包括皮下血肿、呕血、黑便、阴道流血、肉眼血尿、颅内出血等;②休克;③重要脏器功能障碍或衰竭:肝脏损伤[丙氨酸氨基转移酶(ALT)和(或)天门冬氨酸氨基转移酶 > 1000 IU/L]、ARDS、急性心功能衰竭、急性肾功能衰竭、脑病(脑炎、脑膜脑炎)等。
  1.3方法
  1.3.1登革热NS1抗原检测 用惰性分离胶促凝管静脉抽血2 ml,在2 h内进行处理,3000 r/min离心5 min,留取血清待用。使用北京万泰生物药业股份有限公司生产的登革病毒NS1抗原检测试剂盒(酶联免疫法)。
  1.3.2登革热RNA核酸检测 用惰性分离胶促凝管静脉抽血2 ml,在2 h内进行处理,3000 r/min离心5 min,留取血清冰冻保存待用。仪器为ViiATM7实时荧光定量PCR系统,使用登革病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法),由中山大学达安基因股份有限公司提供。
  严格按照仪器和试剂盒操作规程操作,并保证仪器使用良好和室内质控在控的情况下检测标本。
  1.4观察指标
  登革热NS1抗原及登革热RNA核酸等情况。
  1.5统计学方法
  采用统计软件SPSS 18.0对实验数据进行分析,计数资料以率表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
  2结果
  2.1登革热NS1抗原检测阳性率的统计
  366例疑似病例中阳性标本为347例,总阳性率是94.8%,其中男性患者阳性标本为143例,女性患者阳性标本为204例。
  2.2登革热RNA核酸检测阳性率的统计
  366例疑似病例中阳性标本为351例,总阳性率是95.9%,其中男性患者阳性标本为145例,女性患者阳性标本为206例。
  2.3两项结果的比较
  366例疑似病例中,登革热NS1抗原检测阴性标本为19例,登革热RNA核酸检测阴性标本为15例,两项目同时阴性标本为10例,356例则为确诊病例,其中14例两项目检测结果不一致,登革病毒NS1抗原检测阳性而登革病毒RNA核酸检测结果阴性为5例,登革病毒RNA核酸检测结果阳性而登革病毒NS1抗原检测阴性为9例,联合检测的阳性率为97.3%。
  3讨论
  登革热是由登革病毒引起的一种急性发热性传染病,埃及伊蚊和白纹伊蚊(俗称花蚊子)是主要传播媒介,我国广东、海南、广西、台湾和东南亚为高发地区,5~11月最为流行,登革热临床上分轻型、典型和重型。重型登革热病死率达90%以上,其特征为发热、关节痛、肌肉痛、皮疹、淋巴结肿大和白细胞减少。登革热是一种自限性疾病,通常预后良好,一般情况下,治疗一周左右就能愈合。而患者的既往感染登革病毒史、年龄、基础疾病和并发症等可以影响预后。少数重症登革热病例可因重要脏器功能衰竭而导致死亡。
  2014年6月开始,广东省多地暴发登革热疫情,截止10月13日,广东省共有20个地级市累计报告登革热病例31 136例,此次登革热疫情尤在广州受灾特别重。报告重症病例20例,死亡病例6例,这也是近十年来广州首次出现死亡案例。
  传统的登革病毒的常规实验室诊断方法主要有病毒分离鉴定、血清学检测方法和免疫学方法。病毒分离法和血清学检测方法至少需要5~6 d时间才能出结果,费时繁琐,达不到早期快速诊断的目的,而且与其他黄病毒存在广泛的交叉反应,极易出现假阳性[10-11]。免疫学方法进一步提高了灵敏度和特异度,但检测结果也与其他黄病毒存在着一定程度的交叉反应。随着分子生物学技术的不断发展与完善,一些新型检测方法应运而生。当暴发登革热疫情时,快速、简便、特异的实验室诊断方法显得尤为重要。2014年,登革病毒NS1蛋白和RNA核酸检测首次获准大量应用于临床,这对登革热的快速确诊提供了直接方便的检测方法,对及时治疗和控制疫情起到了重要的作用。目前已经证实,在初次和二次登革热感染的急性期患者血清中均存在较高浓度的NS1循环抗原,因此NS1可以作为登革热感染早期诊断的一个理想靶抗原。另外,在患者发病4 d之内尚未检测到特异IgM时,却能检测NS1,这些结果说明了NS1可作为早期诊断登革热感染的靶标[12]。
  登革病毒是一种是以RNA作为遗传物质的病毒,不同物种之间的遗传物质不论RNA或者DNA都有特异性的碱基排列,通过特异性检测人血清中存在的登革病毒RNA来实现检测登革病毒的目的,在登革热的早期诊断中本研究建立的RT-PCR具有较高的灵敏度、特异度和重复性,可用于登革热的快速诊断。
  据陈燕清等[13]报道,登革热抗体IgM阳性率为89.5%,登革热抗体IgG阳性率为38.0%,阳性例数多集中在出现临床症状后5~7 d,徐文体等[14]报道,66.67%的病例登革病毒IgM阳性,39.08%的病例IgG阳性。本研究登革热NS1抗原检测阳性率为94.8%,登革热RNA核酸检测阳性率为95.9%,联合检测的阳性率为97.3%,比传统的抗体检测阳性率明显高。这与已有报道[13]的实验证明登革热NS1抗原检测在登革热的发病早期检出效果可能要优越于IgM抗体的检测的结论一致。
  综上所述,登革热NS1抗原和登革热RNA核酸检测可用于登革热的早期快速诊断,并具有优于传统方法的特点,一旦出现登革热疫情,登革热NS1抗原和登革热RNA核酸检测在早期诊断和迅速控制疫情方面起了重要的作用。由于登革热NS1抗原和登革热RNA核酸检测首次应用于临床,检测方法的优化、检测试剂盒的质量控制以及检测结果的分析等方面有待进一步的研究。[参考文献]
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