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黑曲霉发酵对麦麸多酚及其抗氧化活性的影响

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小麦是我国最重要的粮食作物,主要用于制粉。麦麸是小麦制粉过程中主要的副产品,占小麦加工量的20%左右。目前,我国麦麸的年产量可达3 000万吨以上,但由于其适口性差,尚未得到很好的利用,主要用于饲料。麦麸中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素、酶类和酚类化合物。麦麸含有的酚类主要为酚酸,类黄酮和木酚素3种。麦麸中的酚酸化合物主要为阿魏酸,含量为0.4%~1%[1-2]。阿魏酸是绝大多数植物体内都存在的一种酚酸,化学名称是4-羟基-3-甲氧基肉桂酸[3],研究表明:阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗突变、防癌、免疫调节等功能活性[4-5]。目前,阿魏酸是国际公认的天然抗氧化剂,被用于医药、保健品、化妆品、食品添加剂等行业。阿魏酸的提取主要是以当归、川穹等一些中草药为原料,成本较高。以麦麸为原料制备阿魏酸,由于麦麸来源广泛、价格低廉,若从麦麸中提取阿魏酸,将会降低成本,提高麦麸的深加工和再利用程度,增加麦麸的经济价值。

1 材料与方法

1.1 材料

麦麸(购于商州区农贸市场),马铃薯(超市购买),黑曲霉(2169)(从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的菌粉)。

1.2 方法

1.2.1 麦麸处理

麦麸干燥、粉碎过40目筛后备用。

1.2.2 培养基配制

马铃薯液体培养基:200 g马铃薯,洗净去皮然后切成小块,加水1 000 mL,煮沸30 mim后用纱布过滤,再加20 g葡萄糖,充分溶解后定容到1 000 mL,121 ℃灭菌30 min。

马铃薯固体培养基:在液体培养基中加入2%左右的琼脂,加热至100 ℃溶解,40 ℃下冷却并凝固,成为固体培养基。

1.2.3 孢子悬液的制备

将黑曲霉菌粉转移至液体马铃薯培养基中活化1 d,然后蘸取菌液接种到马铃薯斜面培养基上培养三代,第三代产生的孢子用无菌水从斜面洗下孢子,调整孢子数为1×107 CFU·mL-1[6]。

1.2.4 黑曲霉培养

参考文献[7-8],设计黑曲霉在麦麸中的培养时间分别为1、3、5、7 d。分别称取10 g麦麸于已标记好的三角瓶中,加入60%的蒸馏水,121 ℃灭菌20 min。其中,每瓶接种量为1 mL孢子悬液,不加孢子悬液的作为对照,三个重复。

1.2.5 麦麸多酚的提取与浓缩

对麦麸的提取浓缩参照文献[9-11],发酵好的麦麸用100 mL 80%乙醇50 ℃浸提30 min,提取3次,浸提液4 000 rpm离心10 min,然后收集上清液用旋转蒸发仪蒸干,用5 mL甲醇溶解,保存,备用。

1.2.6 总酚含量测定

称取10 mg阿魏酸标品,溶于80%甲醇溶液并在50 mL容量瓶中定容至50 mL,配成0.2 mg·mL-1的标准阿魏酸溶液。分别取上述溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL的容量瓶中,用80%甲醇溶液定容至10 mL,得到20、40、60、80、100 μg·mL-1的阿魏酸标准溶液,各取该溶液0.5 mL于带塞的试管中,分别加入2.5 mL蒸馏水,混匀,再加入福林酚试剂0.5 mL,混匀,然后加入质量浓度为7.5%的碳酸钠溶液1.5 mL,混合均匀,室温下避光保存30 min后于760 nm波长处测定吸光度,以不加孢子悬液作为空白对照,结果以麦麸中含有相当阿魏酸的毫克数表示,单位为μg·g-1。以吸光度为纵坐标,阿魏酸含量为横坐标绘制标准曲线[12]。

结果见图1所示。线性方程为y=0.008 6x+0.013 6,R2=0.999 2,表明阿魏酸在试验浓度范围内呈现良好的线型。

1.2.7 阿魏酸的高效液相色谱分析

麦麸中含多种酚酸化合物,其中,含量最高的是阿魏酸。但在麦麸中,阿魏酸主要以结合形式存在,阿魏酸的测定采用高效液相色谱法,色谱柱为C18柱(250 mm×4.6 mm,0.5 mm),波长 280 nm,流动相:A液为0.1%甲酸水溶液(0.1%的甲酸,5%的乙腈和94.9%的水混合制得);B液为100%乙腈,线性梯度洗脱,流速为1.0 mL·min-1,进样量 20 μL。梯度洗脱程序:0~7 min(95%A 液,5%B 液),7~12 min(78%A液,22%B液),12~20 min(81%A液,19%B液),20~22 min(95%A 液,5% B液)。阿魏酸标品,溶于80%甲醇溶液,配成100 μg·mL-1的标准阿魏酸溶液,样品稀释10倍,用0.45 μm有机微滤膜过滤。根据出峰时间定性,峰面积定量。阿魏酸在HPLC中的色谱图如图2。

分别以阿魏酸的标准浓度作为自变量,对应的峰面积作为因变量,对测定结果进行线性回归绘制标准曲线,结果见图3所示。线性方程为y=771 63x-166 108,R2=0.998 6,表明阿魏酸在试验浓度范围内呈现良好的线型。

1.2.8 抗氧化活性的测定

1)清除DPPH自由基能力的测定

准确移取适当稀释的样品溶液0.2 mL于带塞的试管中,加入0.1 mmol·L-1的DPPH(80%甲醇溶解)溶液3.8 mL,混匀,常温避光反应30 min后于517 nm波长处测定吸光度值。以80%甲醇溶液代替样品作为对照,以80%甲醇溶液调零,DPPH自由基的清除能力以其清除率表示。各个样品的酚类化合物的DPPH自由基的清除能力的计算公式为[13]:

DPPH自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100%

式中:A1为样品组的吸光度;A0为对照组的吸光度。

2)总还原能力的测定

参考文献[14],并加以修改。准确移取1 mL适当稀释的样品溶液于带塞的试管中,加入1 mL 0.2 mol·L-1的磷酸缓冲溶液(pH为6.6),再加入1%的铁氰化钾(K2Fe(CN)6)溶液1 mL,混合均匀,在50 ℃水浴锅中水浴20 min,然后急速冷却,再加入10%的三氯乙酸溶液1 mL,混合均匀后3 000 rpm离心10 min。移取上清液2.0 mL,加入2.0 mL蒸馏水后再加入0.4 mL 0.1%的三氯化铁溶液,混合均匀,室温下反应10 min,在700 nm波长处测定其吸光度值。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉培养时间对麦麸总酚含量的影响

麦麸接种黑曲霉培养1~7 d,在不同的培养时间内,测定麦麸中总酚含量,结果如图4所示。

由图4可见,麦麸在黑曲霉的作用下,总酚的含量先增加,第3 d时达最高,为不加孢子悬液空白对照的2.4倍左右。随后含量降低,这可能是由于黑曲霉发酵麦麸产生的酶可降解麦麸中结合态多酚的链接键,使麦麸中可提取总酚的含量增加。但随后,黑曲霉又以酚酸为其呼吸的碳源,从而总酚含量下降[4]。

2.2 黑曲霉培养过程中阿魏酸含量的变化

培养过程中阿魏酸含量的变化如图5所示。黑曲霉接种培养3 d后,麦麸多酚的色谱图如图6所示。

由图5可见,麦麸在黑曲霉作用下,阿魏酸的含量都有一定程度的变化。且其变化趋势类似于总酚变化。即麦麸中接种黑曲霉后,阿魏酸的含量先增加后降低,主要原因是,黑曲霉发酵麦麸可产生阿魏酸酯酶,阿魏酸酯酶降解麦麸,释放阿魏酸,使麦麸中阿魏酸的含量增加,但随后,黑曲霉又以阿魏酸为其呼吸的碳源,从而导致阿魏酸含量下降。发酵第3 d时,麦麸中阿魏酸的含量由发酵第1 d的65.914 μg·g-1增加到260.869 μg·g-1,增加了3.9倍。

2.3 黑曲霉培养对麦麸抗氧化活性的影响

2.3.1 黑曲霉培养对麦麸DPPH自由基清除能力的影响

麦麸接种黑曲霉,培养1~7 d,在不同的培养时间内,测定麦麸乙醇提取物对DPPH自由基清除能力,结果如图7所示。

由图7可见,黑曲霉培养时间不同,麦麸乙醇提取物对DPPH自由基的清除率变化趋势是先增加后减小,同麦麸中总酚含量的变化趋势基本一致。培养3 d时,麦麸对DPPH自由基的清除率达最大值,说明结合态阿魏酸对DPPH自由基无清除能力,黑曲霉发酵麦麸产生阿魏酸酯酶,阿魏酸酯酶降解麦麸,释放阿魏酸,使麦麸对DPPH自由基的清除率增大。

2.3.2 黑曲霉培养对麦麸总还原力的影响

总还原能力的测定是抗氧化剂将三价铁还原为二价铁的能力,通过测定反应体系中二价铁的含量来评价抗氧化剂抗氧化能力的大小。黑曲霉培养对麦麸总还原力的影响如图8所示。吸光度值越大,表明其总还原力越强。

由图8可见,不同的培养时间,麦麸的总还原能力的变化趋势与总酚含量的变化、DPPH自由基的清除能力的变化基本一致。即黑曲霉培养对麦麸的总还原能力呈先增后降的趋势,培养3 d,麦麸的总还原力最强,进一步也说明游离态阿魏酸对麦麸还原能力起主要作用。

3 结论与讨论

本研究充分利用丰富廉价的麦麸生产阿魏酸工艺可行,黑曲霉发酵能使麦麸中可提取总酚、阿魏酸含量增加,但由于黑曲霉又可以作为阿魏酸其呼吸碳源,从而导致阿魏酸含量最终下降,因此黑曲霉培养时间是提取麦麸中总酚、阿魏酸的关键因素。若能从黑曲霉培养物中提取酶系,则阿魏酸的提取会更加经济。欧仕益等[15]研究也认为采用黑曲霉直接发酵麦麸生产阿魏酸不经济,但可以利用黑曲霉产生的混合酶作用于麦麸生产阿魏酸。本研究发现黑曲霉发酵麦麸产生的酶系可降解麦麸中结合态多酚及阿魏酸的链接键,使麦麸中可提取总酚及阿魏酸含量增加,麦麸抗氧化活性增强。

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(责任编辑:李堆淑)


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