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matK和rbcL序列在半夏属中的应用

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半夏是一味传统的中药材,广布于长江流域,在华北、东北等地也有分布。临床上多用于治疗痰多咳喘,痰饮眩悸,风痰眩晕,痰厥头痛,呕吐反胃等[1-2]。半夏属(Pinellia)是天南星科(Araceae)一个重要的属,该属共9种,其中7种为中国特有[3]。该属被认为是天南星科的一个进化类群[4]。近年来用很多方法对该属以及其他物种的种间亲缘关系进行了研究[5-8]。matK序列是植物叶绿体trnK基因的内含子中的一个开放阅读框,功能与RNA转录体中Ⅱ型内含子的剪切有关,进化速率较快,在科、属级水平能提供较多的进化和系统发育信息[9]。rbcL基因编码核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenas)大亚基,其序列高度保守[10],郑思浩等[11]研究matK+rbcL联合序列能够鉴别半夏及其混伪品,但对matK序列和rbcL序列在半夏属的应用尚未见报道。本研究拟利用matK+rbcL联合序列分析半夏属植物的系统发育亲缘关系,在一定程度上为半夏药材及其近缘种的种间分子鉴定提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料来源

部分半夏样品采自陕西商洛,部分来自genbank下载,其余物种的matK序列和rbcL序列均从genbank下载。经比对剪切后共21条序列,见表1。

1.2 DNA提取、PCR扩增及序列测定

1.2.1 半夏总基因组DNA提取

2015年5~6月份,半夏植物生长盛期内,在商洛学院校园及二龙山采集其新鲜叶片,迅速用硅胶干燥,保存备用。实验室中采用改良CTAB 法[12]提取基因组总DNA后,溶解于少TE溶液中。-20 ℃保存备用。

1.2.2 matK和rbcL序列扩增及测序

参考赵月梅等[13]中的matK序列和rbcL序列的所用的PCR引物、扩增条件及扩增体系。扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后,送往上海生物工程有限公司进行测序。

1.3 数据处理

用ClustalX 2.0对测序获得的半夏的matK序列进行查看和比对。同时,在GenBank数据库中下载其同属植物闽半夏、盾叶半夏、大叶半夏、心叶半夏、掌叶半夏及三裂半夏的matK序列和rbcL序列,共21条用于后续分析。用MEGA5.0计算种间遗传距离,并用matK序列和rbcL序列及二者联合matK+rbcL序列分别构建NJ树分析各物种之间的关系。

2 结果与分析

2.1 种内、种间序列比对分析

将半夏属半夏等7种植物的matK序列及rbcL序列测序或下载获得的序列进行查看和比对后,组成二者联合序列(表2),其中matK序列比对后总长度为418 bp,无插入缺失序列。其中变异位点20个(4.78%),T、C、A、G的含量分别为36.9%、16.8%、29.3%、17.0%;rbcL序列比对后的长度为638 bp,无插入缺失序列,变异位点12个(1.88%),T、C、A、G的含量分别为28.1%、20.7%、28.4%、22.9%。二者相比,matK序列变异较大。二者的变异多位于种间,种内变异较少。

2.2 半夏及其伪品的K2P遗传距离分析

表3及图1均显示了matK序列在种内及种间的K2P距离分布。由表3可知:种间距离最大的为心叶半夏和闽半夏之间,为0.019,种间距离最小为半夏与盾叶半夏之间,盾叶半夏与大叶半夏之间,均为0.001。值得注意的是,闽半夏与其余6个种之间的遗传距离均较大,表明该物种与半夏属其他物种之间亲缘关系较远。

2.3 聚类分析

由matK序列构建的系统发育树只有掌叶半夏,大叶半夏和三裂叶半夏的几个个体各自聚成了一支;同理,由于rbcL序列构建的系统发育树只有半夏、掌叶半夏、三裂叶半夏三个物种的个体能聚在一起。由matK+rbcL联合片段构建的系统发育树(图1)可知:半夏属这7种植物均能独立聚为一支。半夏的7个个体聚在了一起,支持率为65,盾叶半夏与半夏亲缘关系较近,聚在一起,支持率为78。掌叶半夏6个个体聚在一起,支持率为90,三裂叶半夏3个个体聚在了一起,支持率为55,闽半夏与其他种之间亲缘关系较远,最先形成一个独立的枝,支持率为89。

3 结论与讨论

本文用matK和rbcL联合序列分析了半夏(Pinellia ternata)及其同属物种共7个种,包括序列特征、种间遗传距离及种间的亲缘关系。从实验方法上来看,采集自商洛市的半夏植物的matK序列和rbcL序列的PCR反应条件及通用引物应用情况均表现良好,且在采样不足的情况下,在genbank中也有丰富的序列信息可供参考。欧阳钟鸣等[6]研究了掌叶半夏与盾叶半夏、心叶半夏、半夏和石蜘蛛等4个种呈姐妹类群,张乐荣等[8]研究了滴水珠与盾叶半夏聚在一起,石蜘蛛,半夏亲缘关系较近,虎掌与上述几个物种距离较远,形成一个独立的枝。由于这几个研究中所涉及的物种种类和分子标记都不同,因此在进化树的结果上存在较大差异。本文用matK与rbcL联合数据分析半夏属7个物种的亲缘关系发现:闽半夏与其余6个物种之间亲缘关系最远,半夏与盾叶半夏亲缘关系较近,由于缺乏石蜘蛛和虎掌等物种的数据,因此无法判断这两个物种与这7个物种之间的关系。本研究结论能将这7个物种各自聚类,对于半夏属种内之间的物种鉴定有参考意义,但要探讨本属的所有物种之间的亲缘关系,则需要联合更多的基因片段才能提供的足够的变异信息来进行系统分化分析。

参考文献

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[13] 赵月梅,张玲.蒟蒻薯属(薯蓣科)植物DNA条形码研究[J].植物分类与资源学报,2011,33(6):674-682.


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