2009年Weinstein等[22]首次应用高通量测序技术全面研究了斑马鱼的抗体库特征，揭示不同斑马鱼个体间重链VDJ基因的使用频率存在相似性，促进了高通量测序技术在人抗体组分析中的应用。抗体的高通量测序需要考虑实验设计、重链与轻链配对、数据的分析、挖掘及可视化等问题。近5年高通量测序技术在抗体组学的应用可以分为2个时期：第一个时期为2009~2013年，利用抗体可变区与恒定区的混合引物，通过巢式PCR从外周血单个核细胞cDNA中分别扩增抗体重链与轻链基因，然后通过罗氏454测序平台测序(图1A)。

　　应用这一技术从HIV-1患者中分离出了中和力更强的第二代广谱中和抗体，如VRC01、VRC03、CH103-CH106、CH01-CH04、10E8等。结合结构生物学研究者解析出了HIV-1病毒4个重要的保守表位结构域，分别是CD4结合表位、V1/V2区、V3区、gp41蛋白近膜外周区[23-28].对这些抗体成熟通路的解析及HIV-1保守表位的分析，可以指导HIV-1疫苗的设计和生产，从而为预防HIV-1提供了新的思路。尽管这些方法发展迅速，但仍存在诸多问题：如混合B细胞样本增加了特异性增殖B细胞克隆分析的难度;设计在V区的正向引物并不能覆盖所有的抗体基因片段，多个正向引物的混合增加了PCR的偏好性;尽管可以从混合的mRNA样本中同时测出抗体的重链与轻链，但失去了体内重链与轻链的配对信息;454测序平台容易引入碱基缺失与插入，增加了后续分析的难度。

　　针对以上问题，新的技术被开发并成功应用到抗体测序中(图1B-D)。DeKosky等[29]通过物理方法将单个B细胞中的重链与轻链基因连结在一起，实现了内源重链与轻链的配对测序(图1B)。Robinson[30-32]实验室通过细胞标记的方法，在反转录过程中对不同的B细胞cDNA产物5`端引入特异性的标记，有利于纠正PCR过程及测序过程中的错误，并保证了内源重链与轻链的配对(图1C)。最近Georgiou[33]实验室开发了一套新的低花费、单细胞的油滴PCR技术，既可以保持体内重链与轻链的配对又实现了高通量，每次实验可以分析多达2×106个B细胞，提高了测序的广度与深度度(图1D)。

　　5'RACE技术的应用

　　解决了混合引物扩增的偏好性问题，能够更全面的扩增到抗体基因，结合PGM与IlluminaMiSeq平台提高了读段的长度、测序的深度与数据量，更利于抗体组的高通量分析[34].因此，单细胞测序、重链与轻链配对、5'RACE、PGM与IlluminaMiSeq平台应用，将进一步推动抗体组学在抗体生产、自免疫疾病诊断、疫苗生产及癌症相关疾病的研究。

　　抗体组学的生物信息分析如何从数据的海洋中挖掘出有用的信息，用于指导抗体的生产和疫苗的设计，是抗体组学工作中面临的巨大挑战。目前抗体分析中常用的软件及工具如图2所示。其中包括的主要步骤如下：对测序得到的原始数据(Rawreads)进行质量控制，滤掉质量低与长度短的读段并获得干净的数据(Cleanreads);利用IgBlast和IMGT对抗体的可变区进行V(D)J生殖系基因定位(VDJannotation)[35-36];根据生殖系基因定位将每个合并的读段剪切至恰好包含整个可变区域;去除冗余数据，对于每个唯一读段(Uniquereads)记录其总数量;系统化注释获得reads的可变区域并提取CDR3区域;分析CDR3区域并获得抗体的家系信息(Cloneorlineage);获得每个家系中轻重链可变区域的序列特性，并利用重链和轻链各家系的reads数量进行轻重链配对;对配对好的抗体序列通过实验验证功能。

　　利用上述分析软件与流程，人们开展了大量的抗体相关工作的分析，促进了数据的分析与挖掘并加快了免疫学的进展。例如我们课题组最近参与的HIV-1中和抗体的研究，通过连续15年样本的大数据量的分析，解析了HIV-1广谱中和抗体VRC01的成熟与变异速率，结合结构生物学的分析，揭示了VRC01抗体的进化机制，对开发HIV-1疫苗具有重大的意义[37].同时通过对免疫反应中抗体谱数据特征的分析，揭示了年龄、遗传等因素对抗体产生与成熟的影响，为开发相应的针对不同人群的有效疫苗提供了指导[38-39].然而，相对于高通量数据的快速发展，目前还没有一个统一的分析流程，所有的分析软件主要是借助了一些免费的公用软件，针对抗体分析的专一性软件还没有开发出来。现有的分析流程也存在一些问题，如：IgBlast和IMGT对抗体序列进行比对时，不能纠正序列中的错误，导致比对的不准确性;由于D基因较短，IgBlast和IMGT不能准确地定位D基因;抗体成熟过程中AID酶会引入新的突变，增加了抗体的多样性并提高了抗体的亲和力，然而目前的分析不能区分出AID所介导的突变热点;家系进化树的构建完全依赖于序列相似性，没有考虑原始的生殖基因及AID突变的偏好(Hotspot)，会遗漏掉许多基因并使得进化树不能完全反映细胞内重链与轻链的配对情况。所有这些问题是需要下一步抗体数据分析中得到解决。