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预防移植静脉再狭窄的基因治疗进展

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论文摘要:预防移植静脉再狭窄的基因治疗是目前研究热点,目的基因及其载体的选择是基因治疗的最关键步骤。本文是对预防移植静脉再狭窄基因治疗中目的基因及其载体的选择的研究进展进行综述,并指出其在研究中所遇到的问题及今后的研究方向。
论文关键词:基因治疗,移植静脉,再狭窄
  随着医疗水平的发展,像静脉移植等手术方法治疗包括冠状动脉在内的血管狭窄等疾病给病人生活带来新的希望,但术后通畅率逐年下降又给病人带来新的忧虑。目前对预防移植静脉再狭窄主要手段有放射、药物、物理治疗,虽然有一定成效,但效果还是不佳,随着生物科学技术的发展,人们将希望寄托于基因治疗。下面将对基因治疗中目的基因和载体的选择进展进行综述。
  1.目的基因的种类静脉桥再狭窄主要机制就是内皮细胞的损伤;血栓形成;平滑肌细胞的迁移和增殖。这为我们目的基因的选择提供依据。
  1.1促进内皮细胞修复的基因。
  1.1.1内皮型一氧化氮合酶(eNOS)一氧化氮(NO)是体内重要的生物信使分子和效应分子,它具有抑制vsmc增殖、迁移,抑制血小板聚集等功能。而eNOS是NO合成的关键酶,通过将eNOS基因局部转移,是防止移植血管狭窄的有效手段。王晓明等通过给静脉桥转染带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒,再旁路移植到动脉后得出其加速内皮细胞再生、抑制血栓形成,进而抑制内膜增生。
  1.1.2血管内皮生长因子(VEGF)VEGF能高效的刺激内皮细胞的增殖,使损伤的内皮尽快得到修复,也可以间接抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖。VEGF165是最主要的异构体,是其生物学作用的主要形式,也是目前的基因治疗中主要选用的异构体。有研究表明通过腺病毒介导的VEGF过度表达可以使球囊损伤的动脉内皮细胞再生,抑制血管内膜增殖。
  1.1.3肝细胞生长因子(HGF):HGF是一种间质细胞衍生的多功能细胞因子,能刺激血管内皮细胞分裂和增殖,促进血管内皮细胞损伤的修复,但不引起VSMC的增殖。有研究表明转染HGF基因可增强球囊损伤后血管内皮组细胞的功能,有效抑制损伤血管的狭窄。
  1.2抗血栓形成的基因。
  1.2.1组织因子途径抑制物(TFPI)TFPI是相对稳定的糖蛋白,是广谱的Kunitz类型丝氨酸蛋白酶抑制物,其具有很强的抗凝作用。有研究表明通过腺病毒介导TFPI基因局部转染可以显著抑制PICA术后血栓形成和内膜增厚,主要是通过促进血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡而抑制血管的狭窄的。
  1.2.2组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)t-PA纤溶酶原激活剂主要物质之一,主要有血管内皮细胞合成。其主要功能就是裂解纤溶酶原肽键,形成具有活性的纤溶酶。Ross报道t-PA减少能使经皮冠状动脉成形术(PTcA)后血管狭窄,可见t-PA在预防血管狭窄中起到比较重要的作用。t-PA不仅能预防血管狭窄,有项研究也表明tPA基因逆转录病毒载体直接注入介入手术后再狭窄动物模型的血管壁可以减轻狭窄面积,甚至能达到30%。
  1.3抑制VSMC增殖迁移的基因。
  自体移植静脉再狭窄的主要病理特征为内膜显著增厚。增厚内膜主要是由血管平滑肌细胞增殖、迁移等因素形成,其中有很多调节步骤参与当中。这为我们抑制VSMC增殖、迁移提供许多候选基因。单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)是一种能使无活性的核昔类似物轻甲基无环鸟苷转化为磷酸化的细胞毒性形式,诱导DNA链合成中止引起细胞死亡。实验研究表明HSV-tk基因能抑制新生内膜形成、降低内膜面积与中膜面积的比值(I:M)。FAS是一种凋亡受体,在VSMC中表达较多,当FAS配体在血管壁上表达也可以降低新生内膜的形成。抗细胞迁移金属基质蛋白酶(MMPs)基因在VSMC的迁移中有十分重要的作用,组织型金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)及其同家族成员都有显著减低I:M比例.
  1.4联合基因治疗
  由于预防移植静脉狭窄干预靶点太多,而谁是关键基因尚未确定,又加上单一靶点效果并不理想,于是有人联合多个基因进行干预,证明比单一基因干预更有效。Gunn等用C-myb的反义核酸得出能抑制猪经皮冠状动脉成形术后的内膜增生.VanBelle等在兔股动脉上给予VEGF165质粒可以加速内皮化,减少附壁血栓和新生内膜形成。张铁民等实验显示,反义寡核苷酸与VEGF联合应用较两者单用更能显著预防再狭窄。
  2.载体的种类为了获得一个好的临床治疗效果,载体的选择是重要的一步。载体就是将目的基因导入特殊部位的工具,通常分为病毒载体和非病毒载体,它们各有自己的优缺点。
  2.1病毒载体的种类
  2.1.1腺病毒载体腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒,目前的腺病毒载体大多以5型(Ad5)、2型(Ad2)为基础。腺病毒主要优点有转染细胞广泛、携带的DNA量大、感染效率高、重组病毒滴度高、不整合到宿主细胞、理化性质稳定等。以腺病毒介导的基因治疗预防血管狭窄的研究层出不穷。体内转基因表达时间短暂、病毒基因表达的产物引起的毒性反应限制腺病毒这个载体的应用。正因如此,对腺病毒载体的改进正在进行,如经RGD-4C整合素靶向多肽改良后的腺病毒在静脉桥中有更好的转染能力
  2.1.2腺相关病毒载体(rAAV)rAAV源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一。

通用的AAV载体都是基于血清型2,即AAV2。因为rAAV感染效率低、制备成本高且只能包装小于4.7kb的基因序列而在基因治疗中受到限制。
  2.1.3慢病毒载体慢病毒载体(LVs)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统,它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。LVs具有免疫原性低、整合到细胞上长期表达、可感染非分裂期与分裂期细胞等优点.已有研究表明慢病毒载体应用于球囊损伤致血管狭窄研究的可行性。但慢病毒仍具有潜在的产生复制型慢病毒(RCL)和致癌的风险,相关的研究还是有待加强。
  2.2非病毒载体非病毒载体是通过哺乳细胞摄取和细胞间转运大分子物质的机制来把目的基因转入靶器官。虽然非病毒载体具有安全、易得、无免疫源性等优点,但是他们基本上转染效率不高,因此早期在基因治疗研究中没有太高的地位。随着技术的进步,非病毒载体在基因治疗载体选择上占有一定份额,尤其表现在纳米粒子、超声微泡载体上。
  2.2.1超声微泡载体:它的作用原理是通过超声的物理效应使细胞膜上产生可逆的小孔,借助此孔外源性物质进入细胞内。Taniyama等通过超声微泡载体将p53的cDNA转入球囊损伤大鼠颈动脉,得出血管内膜和中膜面积的比值显著降低。虽然超声微泡靶向释放技术的靶向性及无创性的优点已达到大部分实验的认可,但其转染效率不高仍是需要大力研究的。
  2.2.2纳米粒子:它是现在研究比较热门一种非病毒载体,主要是可以使被包裹的目的基因免受水解酶的降解,将目的基因运载到血管平滑肌上,达到治疗疾病的目的。胡新华等通过纳米粒子介导的反义雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因抑制移植静脉内膜增生得出纳米粒子在血管狭窄治疗中是可行的。现在用的纳米粒子主要是PLGA,它有很好的组织相容性,产物没有任何毒性。
  3.总结和展望
  这些年来尽管科研及医务工作者在移植静脉获取技术、药物防治、应用血管外支架和放射治疗等方面做了大量的工作并在预防移植静脉再狭窄上取得一定成效,但是总体效果还是不理想。移植后的静脉因为内皮细胞损伤、炎性细胞浸润、平滑肌细胞迁移增殖、细胞外基质增加等一系列病理改变导致移植静脉再狭窄。随着分子生物学技术的发展,安全、高效的载体出现、多基因联合等综合治疗必将能有效预防血管再狭窄。
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