当前位置: 手机论文网>医药学类>医学论文>

浅析丹皮酚、丁香酚、胡椒碱经皮微透析体内外回收率的研究

阅读技巧m.Lw54.com 手机论文网

  回收率包括绝对回收率和相对回收率。绝对回收率考察的是经过样品处理后能用于分析的药物的比例。相对回收率严格来说有两种。一种是回收试验法,一种是加样回收试验法。前者是在空白基质中加入药品,标准曲线也是同此,这种测定用得较多,但有标准曲线重复测定的嫌疑。第二种是在已知浓度样品中加入药物,来和标准曲线比,标准曲线也是在基质中加药物。

  [摘要] 建立活血止痛膏中有效成分丹皮酚、丁香酚、胡椒碱微透析体内外回收率校正方法,为其经皮药动学研究提供依据。利用高效液相色谱法测定透析液中丹皮酚、丁香酚、胡椒碱的浓度,并计算微透析探针回收率;研究浓度、校正方法对3种成分微透析探针回收率的影响,并考察探针吸附性、体内外回收率的稳定性和重复性。结果表明,以30%乙醇生理盐水作为灌流液时,探针对3种成分均无明显的吸附,短时间内即可从探针上被完全洗脱下来;在8 h 内,3种成分体内外回收率均能保持稳定;交替用含药溶液和空白灌流液灌流探针3次,3种成分体内外回收率基本不变。不同质量浓度丹皮酚(2.46~53.64 mg・L-1)、丁香酚(4.26~32.15 mg・L-1)和胡椒碱(5.75~45.87 mg・L-1)体外回收率分别为(45.7±4.66)%,(41.3±3.96)%,(27.82±2.95)%,即3种成分的探针回收率对浓度没有依赖性;在相同条件下,零净通量法、透析法和反透析法所测得的探针体外回收率几乎相等。因此,采集部位药物的浓度可用体外测得的回收率或在体回收率进行校正。同时也证明了该研究建立的微透析方法可用于活血止痛膏的经皮药动学研究。

  [关键词] 微透析; 丹皮酚; 胡椒碱; 丁香酚; 探针回收率

  活血止痛膏应用历史悠久,能够活血止痛、舒筋通络,临床上广泛用于筋骨疼痛、肌肉麻痹、痰核流注、关节疼痛等的治疗。其中牡丹皮Paeonia suffruticosa Andr.为方中君药,与当归、川芎等配伍能够活血化瘀止痛,胡椒Piper nigrwm L.,丁香Eugenia caryophyllata Thunb.等辛温之品,加强散寒止痛之功。丹皮酚(paeonol,Pae)、丁香酚(eugenol,Eug)和胡椒碱(piperine,Pip)分别是牡丹皮、丁香和胡椒的主要活性成分,均为活血止痛膏中的有效成分[1]。通过检测局部给药后有效成分的吸收,来判断在一定时间内组织、器官中药物的浓度是否达到治疗量,可以指导经皮药用辅料、载药体系及给药方法的优选及应用。

  本研究建立丹皮酚、丁香酚、胡椒碱体内外微透析回收率的测定方法,考察将微透析技术应用于活血止痛膏经皮药动学研究的可行性,为活血止痛膏经皮药动学评价提供依据。

  一、材料

  Waters e2695高效液相色谱仪(2998 PDA检测器,四元梯度泵,控温自动进样器,柱温箱,溶剂脱气机,Empower工作站);Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);微透析系统,包括Pump 11 Elite 型微量注射泵(HARVARD APPARTUS),2.5 mL 玻璃注射器(Hamilton),CMA 30 线性微透析探针(CMA,半透膜长度为1 cm,截留相对分子质量6 000);KQ5200DA数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);1 mL 一次性注射器(常州悦康医疗器材有限公司);津腾尼龙66孔径0.45 μm微孔滤膜;TK20B型透皮扩散试验仪(上海锴凯科技贸易有限公司);MP5002型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

  丹皮酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号110708201407);丁香酚对照品(中国食品药品检定研究院,批号110725201414);胡椒碱对照品(中国食品药品检定研究院,批号110775201405);丹皮酚药品(成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所研制,批号MUST15020401);丁香酚药品(SigmaAldrich公司,批号STBC6086V);胡椒碱药品(成都曼斯特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所研制,批号MUST15071310)。甲醇(Fisher公司,色谱纯);纯净水(娃哈哈集团有限公司);乙酸(Fisher公司,色谱纯);无水乙醇(北京化工厂,分析纯),其他试剂均为分析纯。

  二、方法与结果

  2.1 透析液中Pae,Eug及Pip 含量测定方法的建立

  2.1.1 色谱条件与系统适用性 Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相甲醇酸水(乙酸调节pH至2.8),梯度洗脱,洗脱梯度见表1,流速1.0 mL・min-1;检测波长Pae 274 nm,Eug 280 nm,Pip 343 nm[1];进样量10 μL;柱温30 ℃。

  2.1.2 对照溶液的制备 精密称定Pae对照品5.41 mg,Pip对照品5.11 mg,Eug对照品54.38 mg于10 mL量瓶中,用无水乙醇超声溶解并稀释至刻度,配成质量浓度分别为541,511,5 438 mg・L-1的对照品储备液。将各对照品储备液用30%乙醇溶液稀释,分别得到低(Pae,Eug,Pip质量浓度分别为2.45,6.45,1.42 mg・L-1)、中(Pae,Eug,Pip质量浓度分别为12.75,35.20,13.50 mg・L-1)、高(Pae,Eug,Pip质量浓度分别为53.64,96.10,32.14 mg・L-1)的对照品溶液。

  2.1.3 方法的专属性 将空白灌流液,Pae,Eug,Pip 混合对照品溶液,以及透析液样品注入高效液相色谱仪,在上述色谱条件下,Pae,Eug,Pip的峰形良好,无杂质峰干扰,对称因子、理论塔板数、分离度均符合要求,说明本方法具有较好的专属性,见图1。

  2.1.4 标准曲线的绘制 精密移取一定量的对照品储备液,以30%乙醇

  分别稀释成不同浓度的混合对照品溶液。按2.1.1项下色谱条件检测,以待测成分质量浓度C (mg・L-1)为横坐标,以待测成分峰面积A为纵坐标,进行线性回归,得到Pae, Eug,Pip的标准曲线。Pae在0.865 6~108.2 mg・L-1线性关系良好,标准曲线回归方程为A=52 868C-23 645,r=0.999 6;Eug在0.852 4~106.55 mg・L-1线性关系良好,标准曲线回归方程为A=9 705.7C-5 303.9,r=0.999 5;Pip在0.817 6~102.2 mg・L-1线性关系良好,标准曲线回归方程为A=70 932C-38 598,r=0.999 2。

  2.1.5 稳定性试验 分别取低、中、高3种浓度Pae,Eug,Pip混合30%乙醇溶液于2,4,6,8,10,12,24 h进样,测定3种成分的峰面积,计算RSD。Pae从低浓度到高浓度RSD分别为1.2%,0.62%,0.34%;Eug从低浓度到高浓度RSD分别为1.6%,0.53%,0.35%;Pip从低浓度到高浓度RSD分别为1.1%,0.48%,0.36%,说明在此条件下,3种成分24 h内稳定性良好。

  2.1.6 精密度试验 分别取低、中、高浓度的Pae,Eug,Pip混合30%乙醇溶液,按2.1.1项下的色谱条件在1 d内各连续进样3次,记录峰面积,计算RSD。Pae从低浓度到高浓度RSD分别为2.3%,0.37%,1.3%;Eug从低浓度到高浓度RSD分别为0.65%,0.80%,1.2%;Pip从低浓度到高浓度RSD分别为2.0%, 0.57%,1.3%,说明在此条件下,该仪器精密度良好。

  2.2 线性微透析探针体外回收率方法的建立

  2.2.1 透析法 将线性探针有效渗析窗完全浸没在空白灌流液中,持续加热搅拌[(32.5±0.2) ℃,350 r・min-1] [2]。用空白灌流液灌流探针1 h,流速1.5 μL・min-1。随后将透皮池内溶液换成含一定浓度药物的溶液,继续灌流,每20 min收集1次微透析样品(每次30 μL)。

  2.2.2 反透析法 将线性探针有效渗析窗完全浸没在空白灌流液中,持续加热搅拌[(32.5±0.2) ℃,350 r・min-1]。用空白灌流液灌流探针1 h,流速1.5 μL・min-1。随后用上述相同浓度药液灌流探针,每20 min收集1次微透析样品(每次30 μL)。

  2.2.3 探针吸附性考察[3] 分别采用透析法和反透析法考察探针吸附性,收集6次微透析样品后,将含药溶液换成空白灌流液,继续灌流,间隔20 min,共收集12次微透析样品,用HPLC测定样品中药物含量。以取样时间为横坐标,吸附率为纵坐标,绘制吸附率时间曲线(吸附率=该点透析液浓度/各时间点透析液最高浓度×100%)。Pae,Eug,Pip在30%乙醇生理盐水作为灌流液的条件下,微透析探针吸附率随时间的变化见图2。

  虚线处为将灌流液由含药溶液更换为空白灌流液时间;A.透析法; B.反透析法(图3同)。

  从图2可以看出,当探针外Pae,Eug,Pip浓度高于探针内部时,将药液更换成空白溶剂后,透析液中3种成分的浓度迅速降低,20 min 后Pae,Eug,Pip的吸附率分别为9%,4%,13%,从探针上完全洗脱下来的时间分别为40,20,60 min;当探针外Pae,Eug,Pip浓度低于探针内部时,将药液更换成空白溶剂后,透析液中3种成分的浓度迅速降低,40 min 后Pae,Eug,Pip的吸附率分别为11.5%,7.3%,12.8%,从探针上完全洗脱下来的时间分别为60,40,80 min。

  2.2.4 探针日内稳定性考察[5] 分别采用透析法和反透析法,连续收集样品480 min,利用HPLC测定透析液中药物浓度,计算探针的回收率,考察线性探针在480 min内回收率的稳定性。Pae,Eug,Pip在体外微透析环境下,探针稳定性见图3。

  由图可知,在8 h内,透析法测得的Pae,Eug,Pip的微透析探针回收率分别为(40.93±0.68)%,(32.07±2.29)%,(22.91±1.20)%;反透析法测得Pae,Eug,Pip的微透析探针回收率分别为(36.9±2.33)%,(32.84±1.97)%,(38.52±2.61)%,3种成分在测定时间内探针体内外回收率均能保持稳定。

  2.2.5 探针日内重复性考察[5] 采用透析法测定探针的日内重复性,收集6次样品后将含药溶液换成空白灌流液,继续用空白灌流液灌流,收集6次透析样品;重复上述步骤3次。利用HPLC测定透析液中的药物浓度,按透析法计算微透析探针的回收率,见图4,Pae,Eug,Pip线性微透析探针的日内回收率分别为(40.52±0.45)%,(33.84±0.51)%,(25.96±2.42)%,日内重复性良好。

  2.2.6 药物浓度对探针体外回收率的影响[5] 采用反透析法考察浓度对探针回收率的影响,用一系列含有不同浓度Pae,Eug,Pip的混合溶液灌流探针,流速1.5 μL・min-1,每20 min收集1次微透析样品(每次30 μL),收集6次。每次更换灌注液前需用灌注液平衡1 h。利用HPLC测定透析液中药物浓度,分别绘制浓度回收率曲线,见图5。由结果可知,Pae,Eug,Pip的回收率分别为(45.7±

  2.2.7 校正方法对探针回收率的影响[7] 采用反透析法测定校正方法对探针回收率的影响,以一系列含不同浓度Pae,Eug,Pip的灌流液进行灌注,灌注液浓度见表2。每次更换灌注液前需用空白灌注液平衡1 h,每20 min收集1次样品,重复收集6次。利用HPLC测定透析液中药物浓度,以渗析液(Cd)和灌注液(Cp)中药物浓度差(即渗析液中药物浓度的净增加值)对灌注液中的药物浓度作图,直线与横轴交点处的浓度即为探针周围浓度中药物的浓度,直线的斜率为探针的回收率,方程拟合结果见表3。

  2.3 线性微透析探针在体回收率方法的建立

  2.3.1 微透析探针的植入[7] 取SD大鼠[5周龄,(200±10) g],用0.2 g・mL-1乌拉坦按体重(1.5 g・kg-1, ip)麻醉后,固定于鼠板上,小心剃去腹部毛发;利用引导针穿刺将微透析探针(半透膜长度为10 mm)植入大鼠皮下后,将引导针小心抽回,微透析探针膜留于大鼠皮下组织中;在样品收集前用空白灌流液排除探针内气泡,并以1.5 μL・min-1灌注速率平衡1 h,以修复组织损伤,用红外灯给大鼠取暖。

  2.3.2 微透析探针在体回收率稳定性考察[4] 线性微透析探针植入后,用空白灌流液平衡1 h后,用含有一定浓度Pae,Eug,Pip混合溶液灌流探针,流速1.5 mg・L-1,每20 min收集1次微透析样品(每次30 μL),收集480 min,利用HPLC测定透析液中药物浓度,按反透析法测定探针的回收率,考察线性探针在体回收率480 min内的稳定性,结果见图6。

  由图所知,Pae微透析探针在480 min内的在体回收率保持在(46.80±1.66)%,Eug为(45.06±1.66)%,Pip为(34.15±2.06)%,表明在480 min内3种成分微透析探针的在体回收率稳定。

  2.3.3 微透析探针在体回收率重复性考察[5] 线性微透析探针植入后,交替用一定浓度Pae,Eug,Pip混合溶液和空白灌流液灌流探针,流速1.5 mg・L-1。样品收集前平衡1 h,每20 min收集1次微透析样品(每次30 μL),重复收集6次后用空白灌流液灌流1 h,交替3次。利用HPLC测定透析液中药物的浓度,按反透析法计算探针的回收率,考察探针回收率在体日内重复性。Pae,Eug,Pip线性微透析探针的在体回收率分别为(45.79±1.89)%,(44.00±1.52)%,(35.83±2.38)%,日内重复性良好。

  三、讨论

  活血止痛膏是安徽安科余良卿药业有限公司自主研发的一种橡胶膏剂,年销售额过亿元,为国家医保目录品种、国家中药保护品种,现收载于2015年版《中国药典》第一部[1]。其处方主要由干姜、山柰、丁香、陈皮、牡丹皮、没药、乳香、胡椒、樟脑、冰片等20多味药组成,虽已有文献对其透皮性能进行报道,但对其有效成分的体内过程却鲜有研究。

  微透析技术[1011]是应用于经皮药动学研究的重要方法。由于灌流液的不断流动,所测得的药物浓度为探针植入部位药物实际浓度的一部分,所以探针回收率校正是微透析技术应用于经皮药动学研究的前提。鉴于此,本研究以Pae,Eug,Pip为指标,建立活血止痛膏经皮微透析体内外回收率测定方法,考察微透析技术应用于活血止痛膏经皮药动学研究的可行性,为其体内药动学的研究、基质优选以及制备工艺优化提供理论依据。由结果可知,体内局部药物浓度可以用体外或体内测得的回收率进行校正,微透析技术用于活血止痛膏的经皮药动学研究是可行的。

  微透析探针对脂溶性成分具有一定的吸附性,导致探针体内外回收率较低[4]。本课题组前期对灌流液进行了筛选,由于渗透压和避免探针的吸附性不可兼得,为保证后续试验的顺利进行,本研究选择探针吸附性最小的30%乙醇生理盐水为灌流液。从吸附性试验结果可以看出,以30%乙醇生理盐水为灌流液,探针对Pae和Eug无明显吸附,对Pip略有吸附,3种成分在探针上均不存在死吸附现象,短时间内均可被灌流液洗脱下来。

  在微透析探针体外回收率研究中,透析膜两侧溶剂相同,渗透压相同;而在体内试验中,由于30%乙醇溶液渗透压高于体液,使得灌流液中成分更多地进入组织细胞中,流出液浓度减小,导致本研究中所测的在体回收率与体外回收率有较大差别,胡椒碱的结果尤其如此。多数研究[1011]常用反透析法测得的微透析探针体内回收率来校正所测得的局部药物浓度,本课题组后续将比较不同剂型的体内药动学差异,用体外所测得的回收率或者反透析测得的回收率进行浓度校正对结果没有较大影响,因此,两者均可用于采集部位的浓度校正。

  [参考文献]

  [1] 中国药典. 一部[S]. 2015:1294.

  [2] 于娟,杜茂波,刘淑芝,等. 活血止痛凝胶体外释放和经皮渗透性研究[J]. 中国中药杂志, 2014, 39(24):4778.

  [3] Whitaker G, Lunte C E. Investigation of microdialysis sampling calibration approaches for lipophilic analytes: doxorubicin[J]. J Pharm Biomed Anal, 2010, 53(3):490.

  [4] Sasongko L, Williams K M, Ramzan I, et al. Assessment of in vitro and in vivo recovery of gallamine using microdialysis[J]. J Pharmacol Toxicol Methods, 2000, 44(3):519.

  [5] MartíNez M S M,Hurtado B G,Gandarillas C I C,et al. In vitro study of experimental factors affecting the microdialysis results [J]. Anal Chim Acta, 2002, 459(1):143.

  [6] Song Y, Lunte C E.Comparison of calibration by delivery versus no net flux for quantitative in vivo microdialysis sampling[J]. Anal Chim Acta,1999,379(3):251.

  [7] Ward K W, Medina S J, Portelli S T,et al. Enhancement of in vitro and in vivo microdialysis recovery of SB265123 using Intralipid and Encapsin as perfusates[J].Biopharm Drug Dispos, 2003, 24(1):17.

  [8] Azeredo F J, Dalla Costa T, Derendorf H. Role of microdialysis in pharmacokinetics and pharmacodynamics: current status and future directions [J]. Clin Pharmacokinet, 2014, 53(3): 205.

  [9] Abrahamsson P, Aberg A M, Wins O, et al. Surface microdialysis sampling: a new approach described in a liver ischaemia model[J]. Clin Physical Funct Imaging, 2012, 32(2):99.

  [10] Song Y, Lunte C E.Calibration methods for microdialysis sampling in vivo: muscle and adipose tissue[J]. Anal Chim Acta, 1999, 400(1):143.

  [11] 俞安安,袁芳,杨智承,等. 拉莫三嗪微透析体内外回收率及其影响因素的研究[J]. 中国生化药物杂志,2015,35(10):122.

转载请注明来源。原文地址:http://m.lw54.com/html/yixue/20170228/6822117.html