壳聚糖的复合法降解及降解产物降血糖活性的研究

　　【摘要】 目的研究复合法降解壳聚糖及降解产物的生物活性方法在纤维素酶降解的后期引入H2O2氧化降解壳聚糖。观察其降解产物对糖尿病小鼠生化指标的影响。结果最佳工艺条件为：纤维素酶降解时酶糖比0.2，pH 4.6、50℃、时间为3 h，后续H2O2降解时H2O2用量为0.8～1.0(ml/g)、75℃、时间为1.5 h，所得降解产物的平均分子量约为1 700。工艺所生产的低聚壳聚糖用量为 100 mg/kg时具有明显的降血糖生物活性，其功效甚至优于拜糖苹。结论该复合降解工艺具有成本低，易于工业化，而且所得产品具有较高的生物活性。

　　【关键词】 壳聚糖; 低聚壳聚糖; 降解; 血糖; 生物活性

　　壳聚糖作为天然碱性多糖，其资源量仅次于纤维素，分子量从几十万到几百万不等。降解后的低聚壳聚糖因溶解性增强，容易被吸收利用，尤其是分子量在1 500左右的产品显示出独特的生理活性和功能[1]。目前，由壳聚糖降解制备优质低聚壳聚糖的工业化生产成为该多糖广泛推广使用的瓶颈。在已有研究的众多降解方法中，非专一性酶降解和H2O2氧化降解法比较有望实现大规模化生产。其中H2O2氧化降解具有成本低、降解速度快、产品无残毒等优势。但反应在H2O2用量大、温度高及反应时间长的条件下易发生副反应，制备产品的活性也受到质疑。与其相比，酶降解由于无副反应、降解条件温和、降解过程容易控制、产品生物活性高而引起人们的广泛关注[2]。在众多非专一性酶的筛选过程中，纤维素酶因存在广泛，生产成本低，对壳聚糖具有一定降解作用而受到重视，但纤维素酶活力有限，降解效率低，产物分子量分布较宽[3]。为此，本研究在纤维素酶降解的后期向体系内引入H2O2快速氧化降解，以提高反应速率、缩小产品分子量分布宽度。最后对制备的低聚壳聚糖产品进行降血糖生物活性研究，以评价该制备工艺的可行性。

　　一、 器材

　　1.1 材料壳聚糖，济南海得贝海洋生物工程有限公司，脱乙酰度>90%;纤维素酶，天津丽华制剂厂，酶活力≥40 000 U·mg-1;H2O2，30%分析纯。拜糖苹，北京拜尔医药保健有限公司产品;四氧嘧啶，Sigma公司提供。

　　1.2 仪器20m3柔性反应釜，德国进口;小型板框压滤机，浙江省海宁市丰源过滤设备有限公司;DZF-6050型离心喷雾干燥器，常州市一步干燥设备厂;LC-10AD凝胶色谱仪，日本岛津;血糖仪，上海荣盛生物技术有限公司提供。

　　1.3 动物3月龄雄性昆明小鼠，体质量20 ～30 g，军事医学科学院实验动物中心提供。

　　二、方法

　　2.1 降解实验

　　2.1.1 纤维素酶的降解实验在搅拌的情况下，将200 g壳聚糖按1∶50(W/V)混合，加入适量冰醋酸溶解后，快速升温至所需温度，加纤维素酶进行恒温降解。达到预定时间后迅速升温至100℃使酶失活，取样稀释过滤、用凝胶色谱分析产物的平均分子量[3]。实验以酶糖比n、pH和温度T为主要影响因素设计L9(34)正交实验，得最佳组合工艺条件为n=0.1，pH=4.6，T=50℃。

　　2.1.2 H2O2氧化降解工艺条件的确定在纤维素酶降解的`基础上升温至预定温度，加入H2O2后继续降解，到预定时间后取样、过滤分析产物平均分子量。最后在确定的最佳复合降解工艺条件下对壳聚糖进行降解，卸料降温，板框压滤、喷雾干燥后待用。

　　2.2 降解物对糖尿病小鼠生化指标的影响

　　2.2.1 高血糖模型的复制及分组小鼠禁食12 h，四氧嘧啶生理盐水溶液(2%)腹腔注射(一次性给药)，剂量为180 mg/kg，72 h后空腹尾尖取血，血糖仪测血糖，大于11 mol/L的小鼠入选糖尿病模型。取10只正常小鼠为正常组。将造模成功的小鼠随机分成5组，每组10只，分别为模型组，壳聚糖原料组(100 mg/kg)，低剂量降解产物组(100 mg/kg)，高剂量降解产物组(200 mg/kg)，拜糖苹治疗组(20 mg/kg)。灌胃1次/d，连续给药28 d。正常组和模型组灌胃生理盐水。

　　2.2.2 动物标本留取每天观察各组小鼠的进食量、饮水及尿量;给药14 d和28 d后尾尖取血，血糖仪测血糖;实验结束后小鼠被断椎处死，取肝、肾组织，用滤纸吸干表面血迹后称重。