2.3 统计学分析用SPSS13.0软件进行统计分析，所得数据用 ±s表示，组间差异采用t检验。

　　三、结果

　　3.1 纤维素酶的降解过程研究为了考察纤维素酶的催化降解过程，在正交实验确定的最佳组合条件下对壳聚糖进行降解，产物的平均分子量Mw随时间的变化情况见图1。

　　 纤维素酶降解过程

　　图1表明，在开始降解的0.75 h内，产品平均分子量迅速下降。这也证实了纤维素酶对壳聚糖主要进行内切降解反应。随着反应的进行，壳聚糖聚合度减小，产物平均分子量下降趋势变缓。这与产物浓度的增加在一定程度上抑制了降解反应的进行有关。当降解达到3 h后，产物的平均分子量下降趋势非常微弱，维持在2万左右。因此，可在纤维素酶降解3 h后，引入H2O2进行降解。

　　3.2 H2O2氧化降解工艺条件的确定

　　3.2.1 温度对降解过程的影响在纤维素酶降解的基础上，不同温度条件下H2O2氧化降解壳聚糖过程见图2。

　温度对H2O2降解过程的影响 图2表明，引入H2O2后产物平均分子量迅速下降，降解速率基本上与温度呈正比。这可能是壳聚糖分子内部尚存在少量易断裂 “弱键”，如：少数链节上具有呋喃环结构、存在少数戊糖的环状结构、或存在少数开环的半缩醛链节结构。之后产物平均分子量下降比较平缓，且温度越高进入平缓阶段越早。此外，在反应过程中还发现，在高于80℃条件下降解时，所得产物颜色随着降解时间的延长由淡黄色逐渐转变为褐色，且温度越高变化越明显。分析认为当壳聚糖降解到一定程度后，其空间结构由卷曲状转变成短的直链状，氨基基团活跃性增强，易发生羰氨副反应。为了有效控制副反应消耗具有生物活性的氨基，确定后期H2O2氧化反应温度为75℃、时间为1.5 h。

　　3.2.2 H2O2用量对降解过程的影响在纤维素酶降解的基础上，质量质量分数为30%H2O2的用量与壳聚糖用量的比值n对降解过程的影响见图3。

　　 H2O2用量对降解过程的影响

　　由图3可以看出，在反应时间和温度相同的条件下，降解产物的平均分子量随H2O2用量的增加而下降。当用量比增加到0.8以后，下降趋势明显变缓。由此确定后续H2O2的最适用量比值为0.8～1.0(ml/g)。此时，可获得平均分子量约为1 700左右的降解产物。

　　采用纤维素酶与双氧水复合降解壳聚糖与直接采用双氧水降解相比，双氧水降解时间缩短将近50%，产品平均分子量低且颜色较浅[4]。分析认为，壳聚糖溶液经过纤维素酶初步降解后分子量有了很大降低，呈均相溶液，从而抑制了双氧水可能对部分壳聚糖过度降解。此外，降解时间缩短也很好地限制了副反应的发生。

　　3.3 降解产物的降血糖活性研究

　　3.3.1 一般情况的观察实验过程中各组小鼠体重、血糖及内脏重量的变化见表1。表1 小鼠体重、血糖及内脏重量的变化与正常组对照，1P<0.01，2P<0.05;与模型组对照，3P<0.01，4P<0.05

　　经四氧嘧啶注射造模成功后的糖尿病小鼠，出现饮食量增加、多饮多尿、体毛松散及精神萎靡等症状。未经治疗的模型组“三多”症状尤其突出，体重也明显低于正常组(P<0.05)。低剂量降解产物和拜糖苹治疗组的一般症状得到明显改善，体重与正常组无显著差异。壳聚糖原料和高剂量降解产物治疗组的症状改善居中。

　　3.3.2 降解产物对糖尿病小鼠血糖的影响与模型组相比，壳聚糖原料治疗组血糖值虽然有所降低，但并不存在显著性差异。原因为壳聚糖本身分子量过大，不能被有效吸收所致。而高、低剂量降解产物和拜糖苹治疗组的14，28 d血糖值明显低于模型组(P<0.01)。其中，低剂量降解产物的降血糖效果甚至优于拜糖苹。由此说明壳聚糖原料经过本工艺降解后具有明显的降血糖生物活性，且起效较快。与正常组相比，单独使用降解产物并不能使血糖降到正常值。

　　3.3.3 降解产物对糖尿病小鼠内脏的影响由表1中的数据分析可知，除拜糖苹治疗组外(P<0.05)，其它治疗组的肝脏指数虽然高于模型组，但不存在显著性差异。这说明壳聚糖及降解产物对肝脏具有一定保护功能，但效果不显著。同时也证实了临床上广泛使用的拜糖苹降糖药具有对肝脏损害小的优点。对于肾脏，低剂量降解产物治疗组的指数与正常组较接近，而其它治疗组的肝脏指数与模型组接近，明显高于正常组(P<0.01)。可见，使用一定剂量本工艺生产的低聚壳聚糖对糖尿病小鼠进行治疗时，可同时达到保护肝、肾的功效。有关低聚壳聚糖降糖作用机制目前尚不清楚。大多推测为，壳聚糖分子结构中的大量氨基调节机体内pH呈弱酸性，从而增强胰岛素的活性。也有人认为降解后的低聚壳聚糖对动物机体内α-葡萄糖苷酶具有一定抑制作用，阻碍了它从碳水化合物和有关多糖的非还原端切下葡萄糖[5]。根据本研究结果，降解产物的治疗效果与拜糖苹比较接近，而拜糖苹正是α-葡萄糖苷酶的抑制剂，因此，偏向于后者。