病毒宏基因组学方法优缺点及意义

　　随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的论文范文，供大家阅读参考。

　　病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。

　　所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。

　　随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的微生物。病毒宏基因组学(Viral metagenomics)就是宏基因组学在病毒领域的应用，即从环境或生物组织中浓缩病毒粒子的遗传物质进行生物学信息分析的技术。它的应用需要一些交叉学科的创新技术的支持，随机引物PCR和新一代测序技术---高通量测序的应用大大提高了研究的效率和获取信息的丰度，克服大环境中病毒浓度低、易受干扰的不足，拓展了病毒宏基因组学的应用范围和现实作用，为探索未知病毒提供广阔的前景和应用空间。在人类预防疾病、开发疫苗方面具有重大贡献。

　　1、病毒宏基因组学的研究过程

　　对于未知病毒的研究过程如下：SISPA方法是1991年Gregory和Jung在随机引物PCR方法的基础上创造的[6],SISPA-PCR使用含有已知片段的随机引物进行逆转录，这个已知片段在接下来的PCR反应中将作为引物[7],此方法先后经Breitbart[8]和Djikeng[9]等人的改进，在SISPA的基础上建立了RNase、DNase-SISPA联用的方法，增加了样品过滤和DNA酶RNA酶消化等步骤，去除外源污染，发现新病毒。高通量测序(High-throughput se-quencing)也称第二代测序技术或深度测序[10],可以对数百万个DNA分子进行同时测序，一次可同时输出大量数据，打破样品类型局限，最大限度的富集病毒核酸信息。

　　样品通过离心、过滤、核酸酶处理等步骤去除病毒粒子以外的物质和背景核酸的干扰[11],纯化和富集病毒粒子，降低错配率，减少数据量，提高下游分析速率。所以此步骤的富集效果对后来的高通量测序结果的序列数量有决定性影响。将样品中的病毒粒子富集到106个·mL-1以上为理想状态[12].然后进行核酸DNA和RNA的提取。

　　病毒基因组比真核和原核宿主短，在核酸制备过程中要尽量去除污染，一个小的污染可能导致长基因优先测序[13],掩盖病毒基因，可能导致宏基因组分类组成成分的偏差。选取几种随机单引物对提取的核酸进行反转录，用Klenow酶合成cD-NA的第二条链，然后用相应的引物进行PCR扩增，增加样品中低丰度病毒的检出率。不同的随机扩增方法对不同的核酸类型(线型、环形、ss/dsRNA/DNA)有不同的效率[14],应用多种扩增方法和引物可以优化检测大环境中可能的病毒核酸的灵敏度，增加覆盖率。产物进行凝胶电泳检测，电泳条带呈现弥散状，送生物公司进行高通量测序。测序结果产生大量数据，数据的筛选处理和分析是整个过程的又一关键步骤，如果数据分析不好，整个实验就不能得到理想的效果，那么海量的测序数据也就失去了意义。