在无核酸酶的离心管中配制反应液： RNA，1—5μg；逆转录引物 （20um），1μl；RNase free H2O，使总体系为12.5μl（反应液配制在冰上进行）。轻轻混匀，65℃变性10min，立即置于冰上2min后加入：RNA—primer mix，12.5μl；5×RTReaction Buffer ，4μl；dNTP（10mM），2μl；RiboLock RNase Inhibitor ，0.5μl；RevertAid Reverse Transcriptase，1μl。总体系20μl，25℃孵育10min后42℃孵育60min，70℃ 加热灭活10 min，—20℃保存。 设计相应的引物，配制成合适浓度工作液，Real time—PCR仪反应体系液配制：2X all—in—OneTM qPCR Mix（含ROX），10μl；引物（10pmol/μl），上下游各0.4μl；ddH2O，4.2μl；cDNA（适度稀释） ，5μl。总体系20μl。反应条件：95℃，10min，以下反复40个循环；95℃，10s；60℃，20s；72℃，20s。最后结果采用2—ΔΔCT法进行测量。
6.2免疫组化法检测TrKB、ERK1/2的表达
切片后，常规脱蜡至水；3%过氧化氢孵育lOmin，可以灭活内源性酶的活性，蒸水冲洗，5minx3次；微波热修复3min，PBS冲洗，5minx3次；滴加5%BSA封闭液，室温孵育30min；滴加一抗，5—HTiaR 一抗稀释为1：50，PKA稀释为1：100，CREB稀释为1：100，4°C过夜，PBS冲洗，5minx3次；滴加二抗生物素标记的羊抗兔IgG，37°C孵育30min，PBS冲洗，5minx3次；滴加三抗试剂SABC，37°C孵育30min，PBS冲洗，5minx3次；DAB显色剂显色，室温下15inin，蒸馈水冲洗，脱水，透明，封片最后DAB 显色剂显色，室温下20min，蒸馏水终止反应，常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。每只动物取相同部位的3张切片，每张切片选取3个视野，在同一放大倍数、同一光强度下，采用CMLAS 彩色病理图像分析系统，分别计算每张切片中海马组织TrKB、ERK1/2表达的平均光密度。
6.3免疫印迹法测定钙调素（CaM）、钙调蛋白激酶（CaMKⅡ）蛋白表达变化
取新鲜海马约100mg置1.5mlEP管中，生理盐水冲洗两遍，充分剪碎，离心去上清。每管加4℃裂解液1ml，继续剪碎、混匀，低温超声匀浆；14000转离心，5min，取上清备用。取上清5μl，加考马斯亮蓝3μl，去离子水95μl，595nm 处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管OD值；根据样品OD值调整蛋白浓度。样品煮沸5min，冷却后取50μg上样；电件（12%浓缩胶：90v30min；10%分离胶：120v120min）；NC膜转印（70v120min）；5%脱脂奶粉TBST溶液封闭抗体，摇床2h，TBS漂洗5min，3次。一抗孵育（兔抗人CaM、CaMKⅡ多克隆抗体1：500稀释），4℃过夜；二抗孵育（辣根酶标记羊抗兔IgG 1：1500稀释），37℃ 1h；扫描并分析结果，条件设置为曝光2min，CCD自动获取图像，同时以1：1000稀释的小鼠抗大鼠beta—actin单克隆抗体作为内参照，各蛋白相对表达量以相应蛋白/beta—actin灰度值表示。
七、课题创新性
1. 本课题首次系统地由宏观到微观地进行综合研究，能从行为学水平→细胞形态水平→分子水平三个层次经行分析，以期待比较完善地探索百合知母汤抗抑郁功效及其机理。
2. 本课题选用了先进的指标，并且采用蛋白水平和mRNA水平检测方法，检测神经营养因子及相关细胞内信号转导通路中关键因子的变化，以期探寻本方提高抑郁症大鼠脑组织CREBmRNA的表达水平的进一步信号转导机制。
八、预期结果
1. 成功完成大鼠抑郁症CUMS模型的建立，构建良好的实验平台。
2. 探讨百合知母汤抗抑郁机制中三种信号转导系统发挥的作用，筛选百合知母汤抗抑郁的靶点通路。
3. 预计在国内学术期刊上发表论文2篇。
参考文献
[1]吴炫静. 抑郁症的中医辨证治疗研究[D].北京:中国中医科学院. 20xx:15-23.
[2]孙旭海.中医精神疾病分类与症状的古代医学文献整理研究[D].北京:中国中医科学院. 20xx: 1-2.
[3]吴崇胜. 抑郁症中医症候诊断标准研究[D].北京:北京中医药大学. 20xx:19-21.
[4]Nemeroff CB. The neurobiology of depression[J]. Scientific American, 1998, 278:42.
[5]周学东,陈兴宝.抑郁症经济负担研究进展[J].上海医药,20xx, 27(12):539-541
论文题目：
基于多生理参数的动脉硬化检测技术研究
一、选题背景
现代社会中，由于生活节奏加快、精神压力增大、饮食结构不合理、缺乏体育锻炼以及人口迅速老龄化等因素的综合作用，心脑血管疾病的发病率、致残率和死亡率逐年上升，已经成为危害人类健康的第一杀手12]。2014年8月8日，国家心血管病中心在北京发布《中国心血管病报告2013》，报告显示，心血管疾病死亡位于城乡居民总死亡原因的首位，在城市居民疾病死亡构成中占41.1%，在农村居民疾病死亡构成中占38。7%，平均每5例死亡中就有2例死于心血管病，中国心血管疾病流行趋势不容乐观，今后十年心血管病患病人数仍将快速增长，且其患病与致残、致死年龄呈现年轻化趋势。全世界每年死于心血管疾病的人数至少1700万，我国每年死于心血管疾病的人数也高达300多万。在我国，心血管疾病的发病率一直居高不下，特别是改革开放以后，一直是中国人第一致残致死的疾病。
