4.3 敞箱实验

　　敞箱实验（Open—field Test ）是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在陌生环境中某些行为的发生频率和持续时间来反应实验动物的自主行为与探究行为，以尿便次数反应其紧张度。敞箱实验（Open—field Test）：木质敞箱，立方形，长、宽、高为80cm x 80cm x 40cm，内侧壁、底面为黑色，底面用白线划分为面积相等的25块正方形。室内安静环境下将大鼠放置于敞箱底面的中心方格内，人距离敞箱1米之外，记录大鼠在3 min内活动频率。以穿越底面正方形块数为水平穿越格数（4爪均进入方格才记数，为水平运动得分）、以两后肢直立的次数为竖立活动次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分），理毛次数以及大小便次数。每只动物只测1次，测定完毕后彻底清洁敞箱再进行下一只观察。分别于实验前1天、实验第22天和最后1天进行。

　　4.4 Morris 水迷宫实验

　　该实验是对大鼠学习记忆能力的检测，主要包括定位航行实验和空间搜索实验。实验用主要装置包括一个银灰色圆形水池（直径 150cm），一个白色平台（直径10cm），一台跟踪摄像机以及与摄像机相连的计算机，池内盛水，且水温保持在 22—24℃。最后一次敞箱实验结束后第二天开始，首先训练大鼠寻找平台，平台置于水面下 2cm，摄像机位于水池上方约 200cm，能清晰摄取到大鼠的运动轨迹。将水池分为四个象限，将大鼠从任意一个象限放入水中，记录其找到平台的路径及时间，前几次训练中，若时间超过 120s，则引导动物到平台，并在平台上停留10s。然后进行定位航行与空间搜索实验。定位航行实验：训练结束后的第一天，保持平台位置不动，将大鼠随机从一个象限放入水中，开始记录大鼠的运动轨迹及找到平台的时间；空间搜索实验：定位航行实验结束后，将平台撤走，将动物从原平台位置的对侧放入，开始记录 120s 内大鼠的运动轨迹及潜伏期与穿越平台次数。以此做为对空间记忆能力的检测指标。

　　4.4 悬尾实验

　　将实验动物通过固定动物尾端2cm处使其头向下悬挂，动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态的时间。动物表现出的这种典型的“不动状态”，反映了一种被称之为“行为绝望状态”，这种行为绝望模型与抑郁症类似，而且对绝大多数抗抑郁药物敏感，而且其药效与临床药效显著相关。

　　5.尼氏染色

　　正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏小体，它们主要分布于神经细胞的浆中，形状有大有小，如三角形，有的为椭圆形。这些物质能被大部分的蓝色染料所染色，这些染料如焦油坚牢紫（Cresyl fast violet）、亚甲蓝（methylene blue）、甲苯胺蓝（toluidine blue）、硫董（thionin）等将其染为蓝色。但是，当神经细胞受伤后，胞质内的尼氏体更可发生变化，严重的可消失，通过观察尼氏小体的数量可以探知神经元的受损或修复情况。

　　各组大鼠分别于末次给药后麻醉，使大鼠仰卧位固定于实验台上，打开腹腔，掀起右肺，在靠近脊柱处找出下腔静脉和腹主动脉。用止血钳夹住腹主动脉和下腔静脉，接着打开胸腔，用针头经左心室插入升主动脉，后剪开右心耳，进行灌注。先用0.9%的生理盐水250ml经心脏快速灌注冲洗，再用4%的低聚甲醛，O。lmol/L的磷酸缓冲液（PH7.2—7.4）350ml灌注。在灌注固定液过程中后期大鼠颈部、肩部和双前肢逐渐变硬。灌注后取大鼠全脑，10%低聚甲醛固定48—60h。以松果体为标志物，向头侧横向切取3段，每段厚2mm。石蜡包埋，连续切片，片厚lOpin，切片，用于尼氏染色及后期的免疫组化。

　　将脑片置于0.5%甲苯胺蓝（母液：甲苯胺蓝1g，无水乙醇100ml。使用时按1：1比例与新鲜的0.1%NaCl溶液混合成工作液）或焦油紫（焦油紫0.1g；蒸馏水99ml；1%冰醋酸1ml）中室温下染色30min。在75%、95%、100%酒精中各脱色1min，二甲苯透明10min，中性树胶封片。显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数。

　　6.测量生化指标

　　主要包括CREB、BDNF mRNA在大鼠海马内的表达；免疫组化检测TrKB、ERK1/2蛋白的表达；免疫印迹法检查CaM、CaMKⅡ的表达。

　　6.1逆转录—聚合酶链式反应法检测CREB、BDNFmRNA在大鼠海马内的表达 首先匀浆：海马新鲜组织约100mg，加入1ml的TRIZOL试剂，用电动勾浆器进行勾浆；两相分离：分装后样品于15到30℃孵育5分钟。每1ml的TRIZOL试剂勾浆的样品中加入0.2 ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15—30℃孵育2到3分钟。4℃下12000 g离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色紛氯仿相，中间层核上层的无色的水相。RNA全部被分配于水相中，水相的体积大约是勾浆时加入的TRIZO试剂的60%；RNA沉淀：将水相转移到新离心管中。水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入异丙醇的量为每个样品匀浆时加入，1mlTRIZOL试剂加0.5 ml的异丙醇，混勾后15—30℃孵育10分钟后，于4℃ 12，000g离心10分钟；RNA清洗：移去上清液，每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃，7500g离心5分钟；重新溶解RNA況淀：去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5—10分钟，切勿真空离心干燥，注意RNA沉淀不要完全干燥，否则将大大降低RNA的可溶性，部分溶解的RNA样品A260/280比值将小于1.6；溶解RNA时，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55—60℃孵育10分钟。莰得的RNA溶液保存于—70℃；浓度测定：取少量液体用TE稀释（一般1： 100稀释）后，读取其在紫外分光光度计260nm和280nm处的吸收值，A260下读值为1表示40ugRNA/ml；样品RNA浓度（ug/ml）=A260×稀释倍数40ug/ml；RNA纯度检测：RNA溶液的A260/A280的比值范围应在1.8—2.1之间；