三、研究思路与立题依据

　　1.研究思路 百合知母汤是《金匮要略》中治疗百合病的经典方剂。百合病的描述“百合病者，百脉一宗，悉致其病也，欲卧不能卧，欲行不能行……意欲食复不能食，常默默，如有神灵者……”主要归纳为情绪障碍、躯体不适，与现代医学抑郁症的诊断标准有很大的相似性，因此一般将百合病归属于抑郁症范畴。百合知母汤中的部分有效成分能通过提高抑郁症大鼠大脑皮层单胺递质、抑制HPA轴亢进、提高模型动物脑组织BDNF含量等途径发挥抗抑郁效应。

　　CREB 可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点。抗抑郁药物（包括中药）或其它治疗措施可通过调节一种或几种通路，最终激活CREB，调节 BDNF 等基因表达，影响神经元增殖、分化、成熟等可塑性改变，发挥抗抑郁作用。参与调节CREB的各调节因子之间、通路之间存在复杂的交叉联系和相互作用，共同维持着CREB活性的平衡。近年来研究提示：抑郁模型小鼠，存在神经元蛋白和营养因子在海马的表达异常，而这些变化可以被一些中药逆转[44]。当前致力于阐明信号通路、CREB、营养因子、神经再生之间是如何相互联系的，以及细胞靶点、分子应答、行为反应的调节与抗抑郁之间错综复杂的关系。这将有助于我们以CREB为中心了解抑郁症的病理生理机制，并在此基础上研发出疗效可靠、起效迅速、副作用小、经济实用的新药，尤其是帮助我们更好地认识一些中药抗抑郁的可能机制，更充分地利用祖国宝贵的中医药资源。

　　细胞内信号转导通路是目前抗抑郁机制研究的重点和热点。可被多种不同的信号路径激活。环磷酸腺苷（cAMP）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、钙调蛋白激酶（CaMK）等3条通路是目前认为与抗抑郁相关、最主要的信号通路，这3个主要上游通路最终都使CREB磷酸化，进而调节其下游通路的基因表达，完成神经元生化功能，而CREB是上述3种通路的交汇点。

　　前期的研究证实：百合知母汤抗抑郁的机制与提高慢性不可预见性应激结合孤养抑郁（CUMS）模型大鼠海马组织5—HT含量、提高脑组织中CREB（cAMP反应元件结合蛋白）mRNA的表达有关（见7.3）。有鉴于此，我们提出假设：百合知母汤抗抑郁的信号机制可能与以上三种细胞内通路有关，三个通路在抗抑郁机制中可能会有所偏重。

　　围绕假设，基于CREB磷酸化通路，本课题拟将百合知母汤作用于CUMS大鼠，运用ELISA、RT—PCR、免疫组化、Western 印记等方法，检测大脑组织cAMP信号中cAMP和PKA、MAPK信号中TrKB和BDNF、CaMK信号中钙调蛋白（CaM）和CaMK等关键因子，初步探讨百合知母汤抗抑郁的信号机制，筛选出该方抗抑郁的基因靶点。

　　2.立题依据

　　中药复方具有成分多、作用环节多、靶点多的特点，多环节之间具有协同效应。因此研究中药及其方剂的抗抑郁作用具有极大的挖掘潜力，而且对解决日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社会意义[45—46]。

　　四、研究内容及目标

　　1.建立慢性不可预见性应激结合孤养大鼠抑郁（CUMS）模型；

　　2.通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织环磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）含量变化，评价百合知母汤对抑郁症cAMP信号的干预作用；

　　3.通过检测用药前后模型动物大鼠络氨酸激酶受体B（TrKB）和脑源性神经营养因子（BDNF）含量变化，评价百合知母汤对抑郁症MAPK信号的干预作用；

　　4.通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织中钙调蛋白（CaM）和钙调蛋白激酶（CaMK）含量变化，评价百合知母汤对抑郁症CaMK信号的干预作用；

　　五、拟解决的关键问题

　　通过检测cAMP、MAPK、CaMK三条信号转导路径上重要调节因子cAMP、PKA、TrKB、BDNF、CaM、CaMK用药前后的变化，初步评估百合知母汤对以上三个信号转导路径的干预作用，评价方剂抗抑郁的机制，以便进一步筛选出方剂抗抑郁靶点。

　　六、实验研究方案

　　1.实验动物

　　SD雄性大鼠，7—12周龄，体重180—200g

　　2.药物制备

　　按照《金匮要略》中记载的方法：百合七枚（劈）（约20g），知母三两（切）（约10g）即百合：知母=2：1.取百合100g，知母50g，先以清水将百合浸泡12小时，当白沫出，去其水，再加清水20xxml，武火煎开后改为文火，得百合煎煮液1000ml；再用清水20xxml，先武火后文火，得知母煎煮液1000ml；将2次煎煮液混合，文火浓缩得煎煮液1500ml。按照比例配制足够数量百合知母汤煎煮液，放入冰箱—20℃储存备用。临用时取出，浓缩至合适体积。为确保实验结果的可比性，所有实验都用同一批药材。所有药物的给药剂量根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算而来：大鼠（200g）用药量=人（70kg）日用剂量x0.018。每只大鼠的给药体积为1ml/100g。